Eine Publikation der Swissprofessionalmedia AG
Wissenschaft und Forschung: Ausgabe 11/2013, 05.11.2013

Messung der Lipase-Inaktivierung für eine optimale Reiskleiestabilisierung

Reiskleie ist durch den hohen Gehalt an endogenen Lipasen besonders anfällig für Oxidationsprozesse. Herkömmliche Standardanalyseverfahren funktionieren nur indirekt und bringen Nachteile mit sich. Die Entwicklung neuer Analysemethoden zur direkten Lipasebestimmung war Aufgabenstellung für eine Masterarbeit an der ETHZ in Zusammenarbeit mit dem Analytiklabor der Bühler AG.

Christoph Brunschwiler, MSc ETH Lm
ETH Zürich, Institut für Lebensmittelwissenschaften, Ernährung und Gesundheit, Labor für Lebensmittelbiochemie, Bühler AG, Corporate Technology, Uzwil

Beatrice Conde-Petit, Senior Expert Food Science & Technology; Daniel Heine, Projektleiter Biotechnologie; Stefan Kappeler, Abteilung Getreideverarbeitung, Projektleiter Enzyme und Biotechnologie
Bühler AG, Corporate Technology, Uzwil

Prof. Dr. Laura Nyström
ETH Zürich, Leiterin Labor für Lebensmittelbiochemie

Reiskleie ist ein feines, mehliges Material, das bei der Reisverarbeitung während des Schleifprozesses von Braun- zu Weissreis anfällt. Es besteht folglich aus den Randschichten des Reiskorns sowie dem Keim. Weltweit werden so jährlich etwa 70 Millionen Tonnen produziert. Aufgrund des hohen Gehaltes an wertvollen Nährstoffen wie essenziellen Fettsäuren, Proteinen, Nahrungsfasern, Spurenelementen (besonders Eisen und Zink), Vitaminen (vor allem A, B1, B2, B3 und E) und γ-Oryzanol besitzt Reiskleie ein hohes, jedoch weitgehend ungenutztes ernährungsphysiologisches Potenzial für Anwendungen im Lebensmittelbereich.
Dies liegt zu einem grossen Teil daran, dass Reiskleie mit ihrem relativ hohen Fettgehalt von 18 bis 22 Prozent und den endogenen Lipasen besonders anfällig für Oxidationsprozesse ist. Durch den Schleifprozess wird der Fettanteil mit den endogenen Lipasen der Reiskleie in Kontakt gebracht. Der darauf folgende Abbau zu freien Fettsäuren führt zu einem bitteren Geschmack und bildet die Grundlage für Oxidationsfolgereaktionen, welche zur Bildung unerwünschter Ranzigkeitsnoten führen. Folglich ist eine Stabilisierung der Reiskleie unabdingbar.

Standardanalyseverfahren. Doch wie lässt sich erkennen, ob der Stabilierungsprozess die Lipase ausreichend inaktiviert hat? Um den Erfolg einer Stabilisierung hinsichtlich Lagerstabilität zu beurteilen, kommen heutzutage zwei Standardanalyseverfahren zum Einsatz. Zum einen werden Lagertests mit der stabilisierten Reiskleie durchgeführt. Hierbei wird nach definierten Zeitintervallen der Lagerung die Konzentration an freien Fettsäuren gemessen. Eine Konzentration an freien Fettsäuren von weniger als 5 Prozent gilt als gute Reiskleiequalität bezüglich des Grades der Fettoxidation. Eine definitive Aussage zum Erfolg der Stabilisierung ist allerdings erst nach drei bis sechs Monaten Lagerzeit möglich. Zum anderen gilt die qualitative Bestimmung der Rest-Peroxidaseaktivität in Reiskleie als Standardanalyseverfahren. Peroxidase ist hitzestabiler und einfacher zu bestimmen als Lipase und fungiert deshalb als Indikatorenzym für Lipase. Die Methode liefert ein schnelles (ohne Lagertests), aber kein quantitatives Resultat und es besteht die Gefahr, dass die Reiskleie zu drastisch behandelt wird und so Nährwerte verliert. Beide Methoden sind also indirekt und bringen Nachteile mit sich.

Analysemethode zur direkten Bestimmung. Es gibt einen Zielkonflikt zwischen Stabilisierung und dem Erhalt des intrinsischen Nährwertes. Damit sich bestehende (meist thermische) und zukünftige Prozesse der Reiskleiestabilisierung hinsichtlich Nährwert und Energieeintrag optimieren lassen, bedarf es einer Analysemethode zur direkten Bestimmung der Lipaseaktivität.
Dies war der Ausgangspunkt der Masterarbeit von Christoph Brunschwiler, die der Student in den Laboratorien der Bühler AG (Uzwil) durchführte. Das Labor für Lebensmittelbiochemie (ETH Zürich) unterstützte Brunschwiler.

Probenvorbereitung und Hitzebehandlung. Mittels eines dem industriellen Verfahren nachempfundenen Prozesses stellte Brunschwiler vor jeder Analyse oder weiteren Behandlung, ausgehend von Paddy-Reis, frische Reiskleie im Labormassstab her. Die Hitzebehandlung der Reiskleie bei exakt kontrollierten Temperaturen, Produktfeuchten und Verweilzeiten realisierte Brunschwiler in 10 g Ansätzen in einem druckdichten Behälter aus Edelstahl im heissen Ölbad. Vor jeder Enzymaktivitätsmessung entfettete er die behandelten und unbehandelten Reiskleieproben. Die Lipase wurde extrahiert und falls notwendig aufkonzentriert mittels Zentrifugalfiltration (photometrische Methode) oder Querstromfiltration (titrimetrische pH-Stat-Methode).

Photometrische und titrimetrische Methode. Zwei verschiedene Methoden adaptierte und optimierte das Team für die direkte Messung der Lipaseaktivität in Reiskleie. Bei der photometrischen Methode kam ein artifizielles Substrat zum Einsatz. Durch die Aktivität von Lipasen und Esterasen wurde die Freisetzung eines gelben Produktes katalysiert. Die photometrische Messung der Absorptionszunahme pro Zeiteinheit bei 405 nm (gelb) und Raumtemperatur ist deshalb ein direktes Mass für die Aktivität von Lipasen und Esterasen in Reiskleie. Diese Methode ist nicht spezifisch, da sie neben Lipasen auch Esterasen misst, aber sie ist empfindlich (tiefe Nachweisgrenze).
Bei der titrimetrischen pH-Stat-Methode verwendete der angehende Experte als Substrat emulgiertes Tributyrin (ein Trigylcerid). Die Aktivität von Lipasen katalysierte die Freisetzung von Buttersäure. Ein pH-Stat-Gerät (freundliche Leihgabe der Firma Metrohm) sorgte dann durch die automatische Zugabe von Natronlauge für eine konstante Neutralisierung der freigesetzten Buttersäure. Der Verbrauch an Natronlauge pro Zeiteinheit bei 30 °C ist deshalb ein direktes Mass für die Aktivität von Lipasen in Reiskleie. Die titrimetrische Methode ist spezifisch für Lipasen, aber sie ist weniger empfindlich und deshalb zeitaufwendiger als die photometrische Methode.

Ergebnisse. Beide Methoden erlaubten reproduzierbare und direkte Lipase-Aktivitätsmessungen in entfetteter Reiskleie. Die relativen Standardabweichungen bei der Messung nicht stabilisierter Reiskleie lagen zwischen 4 und 5 Prozent. Aufgrund der höheren Empfindlichkeit (tiefere Nachweisgrenze) und des dadurch geringeren Arbeitsaufwandes erhielt die photometrische Methode den Vorzug für weitere Untersuchungen von hitzeinaktivierten Reiskleiemustern (Abb. 1 und 2).
Anwendung der photometrischen Methode zur Aufzeichnung von Inaktivierungskinetiken. Der Einfluss von Behandlungstemperatur, Verweilzeit und Feuchte auf die Hitzeinaktivierung von Lipase/Esterase in Reiskleie ist ersichtlich in Abbildung 1. Empirische Erfahrungen über die Wichtigkeit der Feuchte für eine effektive Stabilisierung konnte Brunschwiler nicht nur bestätigen, sondern auch quantifizieren. Um beispielsweise eine Restaktivität von 20 U/kg zu erreichen, musste Reiskleie mit einer Feuchte von 10 Prozent 40 min lang bei 120 °C behandelt werden. Bei 20 Prozent Feuchte reichte eine Behandlung bei 110 °C für lediglich 5 min, um denselben Effekt zu erzielen. Es liess sich weiterhin zeigen, dass sich die Temperaturabhängigkeit der gemessenen Lipase/Esterase-Inaktivierungsrate durch die Arrhenius-Gleichung beschreiben lässt.
Korrelation mit Standardmethode zur Vorhersage der Haltbarkeitsdauer. Das Team hat ausgewählte, unterschiedlich stark stabilisierte Reiskleiemuster für vergleichende Lagertests (Standardmethode freie Fettsäuren, siehe oben) herangezogen. Abbildung 2 zeigt das Potenzial der photometrischen Methode auf, die Haltbarkeitsdauer von Reiskleie ohne zeitintensive Lagertests vorherzusagen. Für eine bessere Korrelation sind noch mehr Daten nötig, aber es liess sich zeigen, dass Reiskleie mit einer Restaktivität von zirka 100 U/kg oder weniger genügend stabil ist über die Lagerzeit, denn 5 Prozent freie Fettsäuren gelten als gute Reiskleiequalität bezüglich des Grads der Fettoxidation.

Schlussfolgerung. Die entwickelten Methoden zur direkten Lipase/(Esterase)-Aktivitätsmessung stellen sehr nützliche analytische Werkzeuge für zukünftige Forschungsaktivitäten mit dem Endziel hochwertiger Reiskleieprodukte dar. Insbesondere bei der Optimierung und Neuentwicklung von Stabilisierungsverfahren sind die Methoden eine wertvolle Hilfe, um jene möglichst milden Einstellungen oder Verfahren zu finden, bei denen die Reiskleie gerade genügend stabilisiert wird und ein Maximum des intrinsischen Nährwerts erhalten bleibt. ¡



Christoph Brunschwiler (li.) erhielt im März 2013 im Rahmen der Masterfeier von Markus Henggeler (re.), Präsident der SGLWT, den SGLWT-Preis für seine Masterarbeit