Eine Publikation der Swissprofessionalmedia AG
Qualitätssicherung und Analytik: Ausgabe 10/2015, 05.10.2015

Molekularbiologischer Nachweis machts möglich

Mikroorganismen, wie beispielsweise Enterobakterien oder Clostridien, können in der Lebensmittelindustrie zu einer grossen Gefahr werden. Ein vereinfachter Nachweis für das gefährliche Bakterium C.botulinum ist ein wichtiger Beitrag zur Lebensmittelsicherheit.

Autor: Iris Gehard, freie Redakteurin

Bilder: LADR GmbH MVZ Dr. Kramer und Kollegen, Günther Gumhold, Pixelio

Die Gabe von Botulinum-Antitoxin rettete 2009 einer 49-jährigen Frau in Sachsen-Anhalt das Leben. Erst die rechtsmedizinische Untersuchung des Todes ihrer 23-jährigen Tochter kurz zuvor liess den Verdacht auf Botulismus aufkommen, den die Ärzte auf eine gemeinsame Mahlzeit aus selbst eingelegten Heringen zurückführten. Aus deren Resten liessen sich neurotoxinbildende Stämme des Bakteriums

Clostridium botulinum

nachweisen. Laut Robert Koch-Institut (RKI) hatten die Ärzte der Klinik die Vergiftung vermutlich deshalb nicht erkannt, weil es im Landkreis seit mehr als 30 Jahren keine Botulinum-Intoxikation mehr gegeben hatte. In der Tat sind derartige Fälle selten, die Sterblichkeitsrate bei Betroffenen liegt mit 30 bis 50 Prozent jedoch sehr hoch, da es sich bei Botulinum-Neurotoxin (BoNT) um die giftigste bisher bekannte natürliche Substanz handelt. Es ist daher besonders wichtig, dass Hersteller bei Produkten wie Honig für Säuglingsnahrung und vakuumverpackten Lebensmitteln Analysen durchführen lassen. Im Verdachtsfall ist der sichere Nachweis des Gifts jedoch nur im Tierversuch möglich. Der direkte Nachweis der Bakterien ist sehr aufwändig und schwierig. Das molekularbiologische Labor der Labor-ärztlichen Arbeitsgemeinschaft für Diagnostik und Rationalisierung (LADR) in Geesthacht bietet ein Verfahren an, dass diese Nachteile nicht hat: Mittels kommerzieller real-time PCR lassen sich Toxin-Gene von

C. botulinum

nachweisen. Bei einem positiven Ergebnis ist die Bildung des Gifts durch das Bakterium im betroffenen Lebensmittel möglich.

Natürliches Vorkommen.

Wie andere Arten von Clostridien kommt auch

Clostridium botulinum

weltweit natürlich im Boden sowie in den Sedimenten von Gewässern und Meeren vor. Durch Staub- und Erdpartikel kann das grampositive, obligat anaerobe Bakterium auch auf Lebensmittel gelangen. Keimen die Sporen aus und vermehrt sich

C. botulinum

vom Typ A, B, E oder F dort, könnte es auch die Neurotoxine (BoNT) bilden. Solche toxinhaltigen Lebensmittel sind lebensgefährlich: Werden sie verzehrt, führt dies zu Vergiftungserscheinungen, dem sogenannten Botulismus. «

C. botulinum

Typ E steht meist mit dem Verzehr von rohem oder ungenügend erhitztem Fisch in Zusammenhang. Die Ostsee gilt als eine der am höchsten kontaminierten Gegenden weltweit für diesen Clostridien-Stamm. Etwa 4 Prozent untersuchter Ostsee-Heringsproben enthalten

C. botulinum

Typ E», erläutert Burkhard Schütze, Leiter des Bereichs Lebensmittelanalytik bei der LADR.

Das Neurotoxin BoNT ist extrem toxisch und der giftigste bisher bekannte natürlich vorkommende Stoff. Da er die Schlüsselproteine der Reizleitung in den Nervenzellen zerstört, tritt ohne eine schnelle Gabe von Antitoxinen der Tod durch Atemlähmung oder Herzstillstand ein. Das Antitoxin neutralisiert frei im Blut zirkulierendes Gift, ist jedoch unwirksam, wenn das Gift bereits an den Nervenstrukturen gebunden ist. Daher spielt bei einer verdächtigen Erkrankung die Zeit bis zur Diagnose eine extrem wichtige Rolle. Die Hauptsymptome der Erkrankung sind Erbrechen, Durchfall, Atemnot, Schluckbeschwerden sowie Seh- und Motorikstörungen. Laut RKI wurde seit 2001 von 80 Fällen von lebensmittelbedingtem Botulismus berichtet.

Intestinaler Botulismus.

Eine Sonderform stellt der intestinale Botulismus bei Kleinstkindern dar. Gut untersucht, ist hier der Weg über Honig, der von Natur aus mit wenigen Sporen (< 100 Sporen / kg Honig) Clostridien wie beispielsweise

C. botulinum

kontaminiert sein kann. Da bei Säuglingen die Magensäureproduktion noch nicht ausreichend ist, können Sporen in den Darm gelangen, auskeimen, sich vermehren und hier Botulinumtoxin produzieren. Wie bei Erwachsenen wird das Gift resorbiert und gelangt zu den Nervenzellen. Erwachsene sind dank ihres Immunsystems, der Magensäure und ihrer grösseren Körpermasse im Verhältnis zu Säuglingen in der Regel durch Honig nicht gefährdet.

Direkter Nachweis von Bakterium und Toxin sehr aufwändig

. Aufgrund der hohen Sterblichkeitsrate bei Botulismus sind Untersuchungen auf Anwesenheit oder Abwesenheit von

C. botulinum

bei gefährdeten Lebensmitteln wie Honig, Säuglingsnahrung, Konservendosen, dem Inneren von Fleisch- und Fischwaren oder vakuumverpackten Lebensmitteln wie Räucherfisch und Wurstwaren von besonderem Interesse. Allerdings erfolgt die Überprüfung der Lebensmittel auf

C. botulinum

routinemässig eher selten. Häufiger lassen Lebensmittelhersteller lediglich überprüfen, ob ihre Produkte frei von Sulfit reduzierenden Clostridien sind. «Es ist einfach nicht so bekannt, dass ein elegantes molekularbiologisches Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Nichtvorhandenseins der Toxin-Gene von

Clostridium botulinum

existiert» sagt Schütze.

Der direkte Nachweis des Bakteriums ist im Labor unzweifelhaft sehr aufwändig: «Der Nachweis von

Clostridium botulinum

gemäss § 64 LFGB ist nach der Methode 06.00-26 durchzuführen. Das Untersuchungsverfahren umfasst viele Einzelschritte und dauert bis zur Isolation von Reinkulturen eine Woche und länger», erklärt der Bereichsleiter. Der sichere Toxinnachweis ist aus Serum, Erbrochenem oder Lebensmittelresten nach wie vor nur im Tierversuch, mit dem so genannten Toxin-Mäusetest machbar. «Dabei injiziert das Fachpersonal aufbereitete erhitzte und nicht erhitzte Homogenate des verdächtigen Lebensmittels und Extrakte aus Anreicherungs- und Reinkulturen an Mäuse und beobachtet die Versuchstiere», so Schütze. Sterben daraufhin die Tiere, denen die Fachleute die nicht erhitzten Homogenate injizierten, mit den typischen Symptomen und überleben Vergleichsgruppen, die mit Antitoxin geschützt waren, gilt dies als Nachweis für das Vorhandensein von BoNT in der Probe. Dieser Nachweis, der von Dienstleistungslaboren nicht durchgeführt wird, ist Bestandteil der amtlichen Methode. «Im Verdachtsfall von Botulismus sind Toxin-Untersuchungen nötig, hier ist jedoch in erster Linie das Konsiliarlabor für

Clostridium botulinum

am RKI gefragt» so Schütze. Dort können die Fachleute auch immunologische und spektrometrische Verfahren zum Toxin-Nachweis durchführen.

Vereinfachter Nachweis mit real-time PCR.

War die mikrobielle Anzucht der Clostridien Spezies aus den entsprechenden untersuchten Lebensmitteln erfolgreich, so besteht die Möglichkeit, die isolierten Bakterienkolonien mittels 16S-rRNA-Gensequenzierung zu identifizieren. Molekularbiologisch ist hier jedoch, aufgrund von Sequenzhomologien, eine Unterscheidung zwischen

Clostridium botulinum

und

Clostridium sporogenes

nicht eindeutig möglich. Ermitteln Fachleute andere Clostridien-Arten, liegt zumindest

C. botulinum

nicht vor. Die Sequenzierung ist verhältnismässig teuer und kann nur von Speziallabors wie LADR in Geesthacht durchgeführt werden. Als Alternative dazu lassen sich zur Einschätzung des Risikos einer vermeintlichen Toxinbildung durch

C. botulinum

auch weitere schnellere molekularbiologische Verfahren heranziehen. Mit diesen ist es realisierbar, in Lebensmitteln die für den Menschen gefährlichen

Clostridium botulinum

-Toxintypen A, B, E oder F über die Toxin-Gene (bont A, B, E, F) nachzuweisen. LADR führt hier das real-time Multiplex-PCR-Verfahren durch: «Dafür führt das Laborpersonal zuerst eine für Clostridien geeignete anaerobe kulturelle Anreicherung durch. Anschliessend erfolgt die DNA-Extraktion aus der TPGY-Anreicherungsbouillon und im nächsten Schritt führen Laboranten die Multiplex-PCR der Toxin-Gene A, B, E und F durch», erklärt der Bereichsleiter. Fällt diese Untersuchung negativ aus, liessen sich folglich die Toxin-Gene von

C. botulinum

nicht nachweisen. Die Lebensmittel sind also nicht mit

C. botulinum

-Stämmen, die zur Toxinproduktion befähigt sein könnten, belastet. Werden hingegen die Toxin-Gene nachgewiesen, besteht die Möglichkeit, dass die vorhandenen

C. botulinum

-Bakterien unter geeigneten Bedingungen auch tatsächlich die gefährlichen Toxine bilden könnten. «Bei einem positiven PCR-Ergebnis machen Fachleute zudem einen Ausstrich aus der TPGY-Anreicherungsbouillon. Nach 48 h und unter anaeroben Bedingungen untersuchen sie verdächtige Kolonien im Eigelb-Lactose-Agar und im Blut-Agar erneut mittels real-time PCR», so Schütze. Dabei wird eine zweite rt-PCR der Toxin-Gene A, B, E und F durchgeführt. Kommt es auch hier zum «Nachweis» der Toxin-Gene, bedeutet das, dass sich in der Lebensmittelprobe lebensfähige und zur Toxinbildung befähigte

Clostridium botulinum

-Bakterien befinden. Grundsätzlich gilt bei einem positiven Testergebnis, dass hier ein Umgang mit dem Lebensmittel im Sinne der Lebensmittelsicherheit für den Verbraucher massgeblich ist und entsprechende Massnahmen einzuleiten sind.

Vorsicht bei Bombagen.

Trotz der Labortests, die die Hersteller in Auftrag geben, sollten Verbraucher bei Risiko-Lebensmitteln – wie beispielsweise säurearmen Konserven, insbesondere mit selbst eingekochtem Fleisch, Fisch und Gemüse, vakuumverpacktem Knochenschinken und Räucherfisch – grosse Vorsicht walten lassen. Dies zeigt auch der Fall der beiden Frauen aus dem Landkreis Stendal, die von einem selbstgemachten, nicht ausreichend gesäuerten Heringstopf assen. Honig ist in diesem Zusammenhang nicht als Risikolebensmittel einzustufen, aber Säuglinge unter einem Jahr sollten keinen Honig verzehren. Im Supermarkt findet sich auf Honig deshalb in der Regel der Hinweis: Honig ist naturbelassene Rohkost und daher für Kinder unter zwölf Monaten ungeeignet.

«Betroffene Lebensmittel müssen nicht unbedingt geschmacklich verändert sein», warnt Schütze. «Nicht alle

C. botulinum

-Stämme besitzen Proteasen oder Lipasen. Auch die Gasbildung ist nicht obligat.» Wenn es allerdings bei Konserven schon zu einer Bombage und bei Einweckgläsern zu einem selbsttätigen Öffnen gekommen ist, sollten Konsumenten vom Lebensmittel nicht einmal mehr kleinste Mengen probieren, sondern es sofort entsorgen. Grundsätzlich ist zu empfehlen, selbst eingewecktes Gemüse oder Fleisch zweimal zu erhitzen, also zu tyndalisieren. Die Hitze zerstört in einem ersten Schritt eventuell gebildeten Toxine von

Clostridum botulinum

und vegetative Bakterien. Ausgekeimte Sporen lassen sich erst im zweiten Schritt abtöten.

Da kommerziell hergestellte Konserven als sicher gelten, ist die Gefahr an Botulismus zu erkranken, heutzutage sehr gering. Dennoch stellt die Untersuchung der genannten Risiko-Lebensmittel auf die Toxin-Gene von

Clostridium botulium

ein schnelles und geeignetes Verfahren dar, um die Lebensmittelsicherheit zu erhöhen.


Weitere Informationen:
LADR GmbH
www.ladr-lebensmittel.de




Honig ist in diesem Zusammenhang nicht als Risikolebensmittel einzustufen, aber Säuglinge unter einem Jahr sollten keinen Honig verzehren. Im Supermarkt findet sich auf Honig deshalb in der Regel ein entsprechender Hinweis