Eine Publikation der Swissprofessionalmedia AG
Qualitätssicherung und Analytik: Ausgabe 04/2015, 06.04.2015

Realtime PCR für sichere Identifikation

Die Bedeutung von Schnelltest in der Qualitätssicherung wird immer grösser. Dank ihnen lassen sich bereits im Vorfeld Kontaminationen frühzeitig feststellen und betroffene Chargen aussortieren. Mit einem PCR-Test lassen sich jetzt die 8 wichtigsten Serotypen identifizieren.

Autor: Ivo Meier-Wiedenbach, Product Manager Food

Für den Nachweis und die Identifikation von Shiga-Toxin produzierenden Escherichia coli in Lebensmittelproben bietet BIOTECON Diagnostics, ein führender Hersteller von Schnelltests für die Lebensmittelindustrie, mit einer Innovation im Realtime-PCR-Bereich eine umfassende Lösung: Mit einem einzigen PCR-Test lassen sich jetzt die 8 wichtigsten Serotypen identifizieren.

Nachweis und Identifikation.

Shiga-Toxin produzierende Escherichia coli (STEC), auch bekannt als Verotoxin-produzierende E. coli (VTEC) oder enterohämorrhagische E. coli (EHEC), sind dafür bekannt, Krankheiten wie Durchfall, hämorrhagische Kolitis (HC) und das potenziell tödliche hämolytisch-urämische Syndrom (HUS) zu verursachen. STEC werden am häufigsten durch rohes Hackfleisch, rohe oder unzureichend pasteurisierte Milch, Sprossen und Gemüse übertragen. Mehrere Regularien und Verordnungen schreiben daher vor, Lebensmittel auf die Anwesenheit von STEC zu untersuchen: So müssen Unternehmen zum Beispiel in Europa Sprossen und in den USA Fleisch auf STEC testen. Nach den Referenzmethoden CEN ISO/TS 13136 und der USDA-FSIS Methode aus dem MLG 5B führen Labormitarbeiter zuerst ein Screening auf die Pathogenitätsfaktoren stx1, stx2 und eae durch. Ist ein STEC vorhanden, findet im Anschluss eine Identifikation der wichtigsten Serotypen statt. Die dabei gesuchten STEC Serotypen sind häufiger mit schweren Komplikationen assoziiert als andere, so ist E. coli O157 für über die Hälfte aller humanen STEC Infektionen verantwortlich und die «Big Six» Serotypen O26, O45, O103, O111, O121 und O145 verursachen 70 bis 75 Prozent aller non-O157 Infektionen. Ein weiterer wichtiger Serotyp ist E. coli O104, der Auslöser des Ausbruchs von 2011 in Deutschland, und daher Teil der EU-Verordnung Nr. 209/2013.

Nachweissystem.

Das foodproof STEC Screening LyoKit und das foodproof STEC Identification LyoKit bilden ein vollständiges System für den Nachweis und die Identifikation von STEC in Übereinstimmung mit der ISO/TS 13136 und der USDA-FSIS Methode aus dem MLG 5B.

Das Screening LyoKit detektiert alle bekannten Varianten der Shiga-Toxin-Gene stx1 und stx2, sowie den Adhärenz­faktor Intimin (eae), in einer einzelnen multiplex realtime PCR in drei unterschiedlichen Kanälen. Die Methode basiert auf der aktuellen ISO/TS 13136, ist jedoch verbessert, sodass sich zusätzlich die Variante stx2f detektieren lässt, das mit der ISO-Methode nicht erfassbar ist.

Anschliessend kann das Laborpersonal bei einem positiven stx-Screening mit demselben DNA Extrakt eine weitere PCR durchführen, um auf die 8 wichtigsten Serotypen zu untersuchen: Das STEC Identification LyoKit detektiert und identifiziert die 8 häufigsten STEC Serotypen O26, O45, O103, O104, O111, O121, O145 und O157 in einem PCR-Test mithilfe von Schmelzkurven. Durch ein neues und innovatives Assay-Design lassen sich zur Schmelzkurven-Analytik sequenzspezifische 5’Nuclease-Sonden verwenden, wodurch im Gegensatz zu interkalierenden Farbstoffen eine optimale Spezifität erreicht wird. Das LyoKit nutzt hierfür insgesamt 4 Kanäle: Im FAM-Kanal erfolgt der allgemeine Nachweis der 8 Serotypen, eine Differenzierung über Schmelzkurven-Peaks findet in den Kanälen für HEX, ROX und Cy5 statt.
Das Screening LyoKit und das Identification LyoKit umfassen einen vorabgefüllten und direkt einsatzbereiten gefriergetrockneten Mastermix. Für die PCR müssen Fachleute die gereinigte DNA nur in das Well überführen und kurz mischen, weitere Pipettierschritte sind nicht erforderlich. Dadurch verringert sich das Risiko einer Kreuzkontamination. Die LyoKits lassen sich anstatt auf Trockeneis bei Raumtemperatur versenden, was Lieferkosten einspart. Auch die Lagerung ist einfacher, da die LyoKits bei 2 bis 8 °C stabil lagerbar sind, ein Einfrieren der Kits ist nicht notwendig. Die LyoKits lassen sich auf nahezu allen realtime-PCR-Geräten verwenden, die sich für die sogenannten Hydrolyse Sonden eignen (auch als TaqMan- oder 5’Nuclease-Sonden bezeichnet). Sie sind mit denselben Qualitätsmerkmalen ausgestattet wie die bestehenden foodproof Kits. Die im Mastermix integrierte interne Positivkontrolle (IPC) verhindert falsch negative Ergebnisse und das Enzym Uracil-N-Glycosylase (UNG) schliesst falsch positive Ergebnisse, die durch eine Übertragungskontamination entstehen können, aus. Für alle seine LyoKits bietet der Hersteller geeignete foodproof Kits zur Extraktion der DNA an.


Weitere Informationen:
BIOTECON Diagnostics GmbH
www.bc-diagnostics.com



Flow-Diagramm für die Auswertung mit dem foodproof STEC Identification LyoKit: Ist im FAM-Kanal ein positives Signal, so ist mindestens einer der 8 Serotypen in der Probe vorhanden. In den Kanälen für HEX, ROX und Cy5 lassen sich dann die Serotypen über die unterschied­lichen Schmelzkurven-Peaks bestimmen


Beispiel einer Auswertung der Schmelzkurven im ROX-Kanal: Deutlich zu sehen sind, bei unterschiedlichen Temperaturen, die Peaks von O157 (42 bis 49 °C), O111 (49 bis 56 °C) und O145 (56 bis 62 °C)